牛磺鹅去氧胆酸对大鼠脂肪代谢的影响(四)

4 TCDCA对大鼠肝脏组织中FXR表达的影响

4.1试验材料

4.1.1试剂与药品

30%过氧化氢（风船化学试剂公司）；PBS磷酸盐缓冲液（迈新公司）；citrate柠檬酸盐缓冲液（中杉金桥公司）；苏木素（中杉金桥公司）；Anti－BIile Acid Receptor NR1H4  MD6445（百奥思科生物公司）；DAB kit（中杉金桥公司）；通用型SPkit（中杉金桥公司）；封闭液（博士德生物公司）；抗体稀释液（博士德公司）；SYBR Primix Ex Taq^TM II（日本TakaRa公司）；HiSCript QRT SuperMix（南京诺唯赞公司）；axyPrep^TMMultisource Total RNa Miniprepkit250－Prep（美国axygen公司）；SDS－PaGE凝胶试剂盒（索莱宝生物公司）；anti－BIile acid Receptor NR1H4 抗体（abcam公司）；Goat anti－RabbiltIgG（H＋L）－HRP（天津三箭生物公司）；Western Blot—抗稀释液（碧云天生物公司）；二抗稀释液（碧云天生物公司）；总蛋白提取试剂盒（南京诺唯赞生物公司）；BCa蛋白定量试剂盒（南京诺唯赞生物公司）；5X蛋白上样缓冲液（碧云天生物公司）；ECL化学发光显色液（德国Thermo公司）；预染蛋白Marker（德国Thermo公司）；引物序列合成（英潍捷基公司）。

4.1.2主要仪器设备

高压灭菌锅SX－500（日本Tomy公司）；－20°C低温冰箱（海尔公司）；全自动脱水机（德国莱卡公司）；石蜡切片机（德国莱卡公司）；正置荧光显微镜（德国莱卡公司）；加热石蜡包埋系统（德国莱卡公司）；611UF纯水仪（Biotech公司）；Vii7实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；PCR仪DYY－III型（上海森信公司）；多功能酶标仪Synergy4（美国Bio Tek公司）；焚光成像分析系统（德国耶拿公司）；蛋白电泳仪（德国伯乐公司）；XCell II^TM Blot Module CE Mark（上海英潍捷基公司）。

4.2数据统计与分析

蛋白灰度值分析应用Image J软件进行分析。试验结果用SPSS19.0软件进行统计学分析。实验结果用x±S表示，两个样本均数比较采用t检验，两个以上样本比较采用F检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

4.3研究内容与方法

4.3.1FXR表达位置的研究

4.3.1.1石蜡包埋

同2.3.1.4中的步骤（1）。

4.3.1.2组织切片制作

同2.3.1.4中的步骤（2）。

4.3.1.3免疫组化

（1）石蜡切片经过脱蜡、水化处理后，用PBS溶液漂洗3次/min。

（2）抗原修复：将切片置于抗原修复液中，用电磁炉加热至沸腾并维持7min，室温冷却，用PBS漂洗5minX3次。

（3）免疫杂交：将3%H₂0₂滴加到切片上，使其完全覆盖组织，室温环境.孵育10min，目的是消除内源性过氧化物酶活性。用PBS漂洗3次/5min。滴加封闭液（5%BSa），在湿盒中室温孵育30min。用滤纸吸去切片上的封闭液。一抗：无酶水＝1：150混合均匀后滴加到切片上组织，将切片置于湿盒4°C环境中孵育过夜，再用PBS漂洗3次/5min去除未与组织发生结合反应的一抗。滴加生物素化二抗工作液，室温下置于湿盒中孵育20min，用PBS漂洗3次/5min洗去二抗。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，使其完全覆盖组织，置于湿盒中室温孵育20min，PBS漂洗3次/5min。

（4）显色和封片：将DaB显色剂充分混合均匀后滴加到切片组织上，避光环境中显色约10min后，用自来水充分漂洗。再用苏木素染液将切片依次进行复染、脱水、透明等过程，最后用中性树胶封片。

4.3.2TCDCA对FXR mRNA表达量的影响

4.3.2.1引物合成

FXR的引物序列为：上游5＇—TGG ACT CAT ACA GCA AAC AGA GA—3＇，下游5＇—GTC TGA AAC CCT GGA AGT CTT T—3＇；β－actin的引物序列为上游：5＇一GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA—3＇下游：5＇—GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG－3＇。

4.3.2.2组织总RNA的提取

（1）称取20－40mg的肝脏，置于预冷的研钵中，加入液氮使肝脏瞬时冷冻后快速研磨成粉末状。

（2）研钵中加入400uL Buffer R－I溶液，用移液器反复吹吸10次左右，将溶液转移至无菌无酶离心管中。

（3）离心管中再加入150uL Buffer R－II溶液，充分混匀后12000 X g离心5min

（4）将上清用移液枪吸出并转至一个新的1.5mL无菌无酶离心管中，再加入250uL异丙醇（自备），充分混匀。

（5）将制备管置于2mL离心管中，上一步中的混合液转移至制备管中，6000Xg离心1min。

（6）弃去离心管底部的滤液，将制备管重新置于2mL离心管中，再在制备管中加入500uLBuffer W1A溶液，12，00Xg离心1min。

（7）继续弃去离心管底部的滤液，将制备管重新置于2mL离心管中，再在制备管中加入700 uLBuffer W2溶液，1200Xg离心1min；重复该操作一次。

（8）弃去离心管底部的滤液，将制备管再放入2mL离心管后12000 X g离心1min

（9）将制备管另放至1.5mL无菌无酶离心管中，在制备管中加70－100uLBuffer TE溶液。

（10）室温环境静置1min后12000 X g离心1min，洗脱后在离心管底部获得RNA。

4.3.2.3 RNA 反转录成cDNA

（1）配制第一链cDNA合成反应液：按照反转录试剂盒说明书，以总RNA为模板进行反转录合成cDNA，反转录混合液20uL体系如表13所示，用移液器轻轻混匀。

（2）进行反转录反应：反应程序如表14所示，将反转录得到的cDNa置于－20°C保存备用。

4.3.2.4 qPCR法检测FXR mRNA的表达

大鼠肝脏中FXR相应RNa相对表达量的检测采用SYBR Primix EX Taq^TMII，25uLqPCR反应体系按试剂盒说明书配制如表15所示。本实验所采用的两步法反应过程为95°C，30S；95°C，5S；60°C退火40S；扩增40个循环，每组做8个重复。用下列公式计算各组大鼠肝脏中FXR的MRNA相对表达量。

4.3.2.5制作qPCR扩增效率曲线

为了验证FXR的cDNA是否可以利用2^-ΔΔCt公式进行其相对表达量的计算，将cDNA以10倍梯度稀释至10⁹，然后分别作模板进行qPCR扩增，制作扩增效率曲线。若FXR基因表达量的对数值（y）与Ct值（x）成反比例关系，则可以利用2^-ΔΔCt公式计算FXR基因在肝细胞中的相对表达量，即计算出FXR基因与内参基因（β－actin）的CT差值为ΔCT（ΔCT=CT目的基因/Ct内参基因），以低、中、高TCDCA组的Ct值减去阴性对照组的Ct差值，即为

ΔΔCt （ΔΔCt=Ct给药组基因/Ct阴性对照组），将转化为相对差异倍数，即QR＝2^-ΔΔCt。

4.3.3TCDCA对FXR蛋白表达量的影响

4.3.3.1组织总蛋白的提取

（1）裂解液的制备：每500uL预冷Lysis Buffer中加入2uLProtease Inhibitor Mix混匀后置于冰上备用。

（2）称取100mg肝脏于研钵中，加入液氮瞬时冷冻后研磨至粉末，加入一定量裂解液。

（3）将肝脏匀浆吸入一个新的预冷的无菌无酶离心管中，4°C、16000 X g离心5min。

（4）用移液器将上清液快速转移至另一预冷的无菌无酶离心管中，即可得到肝脏组织总蛋白。

（5）将总蛋白分装至小的无菌无酶离心管中，避免反复冻融，－80°C环境保存以备用。

4.3.3.2BCA法检测蛋白浓度

（1）BCA工作液配制：Reagenta：ReagentB＝49：1，混匀，置于冰上备用。

（2）标准曲线的绘制：操作如表16。

（3）反应：振荡充分混合均匀后，37°C环境中反应30min。

（4）测定吸光值：采用酶标仪测定其吸光值，测定波长为562nm，不含BCa的吸光值作为为空白对照。

（5）绘制标准曲线：标准曲线是以蛋白含量（ug）为横坐标，吸光值为纵坐标。

（6）样品测定：用去离子水稀释待测蛋白样品至适宜的浓度，取20uL稀释好的蛋白样品，加入200uL BCA工作液，充分混合均匀，37°C反应30min，然后以0号孔为对照，用酶标仪测定样品的吸光值。

（7）计算蛋白浓度：将测得的蛋白样品吸光值代入制作好的标准曲线计算其蛋白含量，蛋白浓度计算公式如下：蛋白浓度（ug/uL）＝蛋白含量（ug）/蛋白样品20uL X样品稀释倍数。

4.3.3.3上样样品置备

将蛋白上样缓冲液加入到样品中，使每上样孔中含50ug蛋白，100°C变性5min，－20°C保存备用。

4.3.3.4 Wester Blot的操作步驟

（1）SDS－PaGE凝胶配置

①分离胶：按说明书配制10% SDS－PAGE分离胶，混匀后立刻注入玻璃凝胶板中，超纯水封层，水平桌面上室温静置约30min。

②浓缩胶：弃取封层的超纯水，用滤纸吸干凝胶顶端的残存水分。按照说明书配制5% SDS－PAGE浓缩胶，混匀后注到分离胶上，插入梳子，水平桌面上室温静置约30min。

（2）电泳

将配制好的凝胶电泳板放进电泳槽，两凝胶电泳板中加满电泳缓冲液，移去梳子，用移液器分别加入事先制备的蛋白样品，每孔含蛋白50ug，选择最左端孔加入预染蛋白Marker约10uL作为对照条带，进行SDS－PAGE电泳。接通电源后将电压设定为100V，电泳2h。

（3）转膜

电泳结束后，以Marker条带作为参考，切下包含目的条带且大小适当的分离胶，放入预冷的转膜液中。剪一块与分离胶大小相近的PVDF膜，置于甲醇溶液中活化1min，再置于预冷的转膜液中。按照XCellII^TMBlot Module CE Mark说明书依次将海绵、滤纸、分离胶、PVDF膜、滤纸、海绵做成“三明治”放入转膜槽，按照说明书在转膜槽内加满预冷的转膜液，转膜槽外加入蒸馏水至外槽体积3/4处，接通电源，25V恒压条件下转膜2h。

（4）封闭

取出PVDF膜，TBST洗涤3次/10－15min。将PVDF膜转移至3%BSA的封闭液中，室温环境总在摇床上封闭1－2h。

（5）孵育一抗

将PVDF膜从3%BSa的封闭液中取出，不用洗涤，再放入1：3000稀释的FXR—抗中，置于4°C环境孵育过夜。

（6）孵育二抗

取出PVDF膜，TBST洗涤3次/10－15min。将PVDF膜放入1：3000稀释的二抗中，室温摇动孵育1－2h。

（7）ECL显色

取出PVDF膜，TBST洗涤3次/uM5min。将显色剂的a液与B液按照1：1的比例暗处混合均匀，均匀滴至PVDF膜上，采用凝胶成像系统扫描，检测蛋白表达信息。

4.4结果

4.4.1FXR的表达位置

本实验采用免疫组化的方法，利用抗原抗体特异性结合反应，用显色剂显色后，发生抗原抗体反应位置的呈棕褐色，其颜色与其他未发生抗原抗体反应不同，从而确定FXR在肝细胞中的表达位置。由图6可以看出，FXR表达于大鼠肝细胞核，且与阴性对照组相比，低、中、高剂量组的大鼠肝脏中的FXR表达量较多。

注：1代表阴性对照组；2代表TCDCA低剂量组；3代表TCDCA中剂量组;4代表TCDCA高剂量组；a组表示显微镜下200X；B组表示显微镜下400X。图中箭头所指位置代表FXR表达位置。

4.4.2溶解曲线和QPGR扩增效率曲线

图7结果显示，β－actin、FXR的熔解曲线的峰形均单一且特征明显，因此表明qPCR扩增产物具有特异性。图8结果显示，Ct值与采用浓度梯度稀释的样品中的β－actin、FXR基因表达量的对数值Y与Ct值（X）成反比关系，相关系数均大于0.998。当相关系数大于0.99时，则表明现线性关系良好，因此可以采用qPCR检测FXR基因的相对表达量。

4.4.3FXR MRNA表达量

由图9可知，TCDCA低剂量组大鼠肝脏中FXR mRNa表达量极显著高于阴性对照组（P<0.01），而中剂量和高剂量组大鼠肝脏中FXR mRNa的表达量与阴性对照组相比则差异不显著（P>0.05）。该结果表明低剂量TCDCA可显著性上调FXR mRNA的表达。

注：★★表示与阴性对照组相比差异极显著（P<0.01）。

4.4.4样品蛋白浓度

如图10所示，标准曲线方程为y＝0.0519x＋0.1248，相关系数R²＝0.9988，线性关系良好，标准曲线方程成立。将测得的蛋白样品OD值代入标准曲线方程，可计算得出样品蛋白浓度。

4.4.5FXR蛋白表达量

由图11结果显示，FXR的免疫条带在59kD处，GAPDH的免疫条带在36kD处。灰度值分析结果表明，与阴性对照组比，低剂量和中剂量组中FXR蛋白灰度值显著性增大（P<0.05），高剂量组FXR蛋白灰度值虽有增大，但无显著性差异（P＞0.05）。该结果提示低、中剂量的TCDCA可显著促进FXR蛋白的表达量。

注：Western blot 结果图中，1代表阴性对照组：2代表TCDCA低剂量组；3代表TCDCA中剂量组;4代表TCDCA高剂量组；★表示与阴性对照相比差异显著（P<0.05）。

4.5讨论

FXR属于细胞核受体，主要表达于肝脏等组织器官^[115］。由免疫组化结果图可以看出，FXR均表达在大鼠肝脏细胞核上，且TCDCA处理组的大鼠肝脏中FXR表达量较多。

另外，四组大鼠肝脏细胞质均匀，肝索界限清晰，细胞核呈圆形，无细胞萎缩、脂肪变性、水肿、炎症和癌变等病理性现象，此结果与HE染色结果相同，进一步表明本实验中TCDCA对大鼠肝脏无细胞毒性作用。

FXR是一种配体激活型转录因子^[116］，FXR不仅在胆汁酸的合成与代谢中发挥重要的作用，而且在碳水化合物代谢和脂质代谢等多方面起着重要的作用^[117]。FXR可降低小鼠肝脏糖酵解和脂肪生成^［53］。有研究报道，清除受体SRB1能够促进血液中HDL－C的清除，FXR基因敲除小鼠的血清中HDL－C和TG水平显著高于正常小鼠，而肝脏中SRB1含量显著降低^[118］，因而提示了FXR可通过影响SRB1的含量对小鼠血清中HDL－C和TG水平发挥调控作用。另有报道证明^［119］，将CA添加到饲料饲喂给小鼠后，小鼠血浆中TG水平显著降低，其降低机制与FXR及其配体介导的信号通路相关，表明胆汁酸对高血脂症的防治具积极作用。TCDCA是胆汁酸的有效成分，目前在国内外尚未见到有关其对能量代谢影响方面的报道。由于FXR是调控脂肪代谢的主要受体之一，且FXR与胆汁酸关系密切，为了研究TCDCA影响脂肪代谢的分子机制，本文探究了TCDCA对脂肪代谢相关受体FXR表达量的影响。实验结果表明，低剂量TCDCA可以显著性上调FXR蛋白以及MRNa的表达，增加FXR的活性，这与免疫组化FXR表达量的结果相同，且与之前报道的胆汁酸可以增加FXR的水平从而调节脂肪代谢结果相符^[33］。由此可见，TCDCA促进动物体内脂肪代谢的作用与其上调FXR的表达量有关。但随着TCDCA剂量的增加，其调节作用发生改变，表明TCDCA对FXR的调节作用与给药剂量有密切关系。

GW4064是被公认的经人工合成的FXR激动剂，与FXR结合力较强，能够促进FXR表达水平^[120-121]。据报道，脂连素（adiponectin，aDPN）是至今发现的唯一与肥胖呈负相关的脂肪细胞特异性蛋白，其血清水平与人体质量指数脂肪组织量呈反比的脂肪因子，具有抗炎、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化的性质，GW4064可通过激动活化FXR升高人肝癌细胞HEP－G2中aDPN的表达水平，进而发挥其对能量代谢的调控作用^[122]。FXR激动剂GW406能升高C57BL/6小鼠血清中皮质酮水平，表明FXR对小鼠体内肾上腺胆固醇代谢以及糖皮质激素合成具有一定调节作用^[122］。CDCA也可作为FXR激动剂，用于FXR相关信号转导通路的研究^［124］。TCDCa能够上调FXR表达水平以及GW4046上调FXR的表达结果，为今后TCDCA作为FXR激动剂调控能量代谢的研究奠定了实验基础，为寻找与TCDCA以及胆汁酸影响脂肪代谢的相关靶基因及信号通路，预测药物作用的分子机制提供线索；可为进一步开发宠物肥胖症的防治药物奠定试验基础，并提供理论依据。

4.6小结

TCDCA可显著升高与脂肪代谢相关的受体FXR基因和蛋白质的表达量。

5全文结论

（1）TCDCA能显著降低大鼠体重，抑制大鼠的增重。

（2）TCDCA极显著升高大鼠肝体比，但对大鼠肝脏组织形态无影响。

（3）TCDCA对大鼠血清中MDA含量无影响，高剂量TCDCA对SOD和GSH-Px活性具有显著抑制作用。

（4）TCDCA可显著升高FXR基因和蛋白质的表达量。

参考文献