悬浮培养技术在生物制药中的应用和前景

细胞悬浮培养是利用生物反应器大规模高密度培养细胞生产生物制品的核心技术，结合筛选驯化的高表达细胞株和个性化培养基，控制细胞培养过程，从而提高生产效率、产品质量和降低成本，但该技术目前国内尚处于起步阶段，随着现代生物技术发展，利用悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。

【关键词】悬浮培养；生物制药；生物反应器

悬浮培养技术是在生物反应器中，人工条件下高密度大规模培养细胞用于生物制品生产的技术，根据细胞分为悬浮细胞培养、贴壁细胞微载体悬浮培养。悬浮培养技术最大的优势是通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量同时能够稳步提高产品品质。下面就悬浮培养产业化的关键技术和问题进行探讨。

1.悬浮培养技术在生物制药中的应用及现状

1962年，Capstick等对BHK21细胞驯化实现悬浮培养，并应用于兽用疫苗生产。1967年，VanWezel开发了微载体并实现了生物反应器中大规模培养贴壁细胞。悬浮培养和微载体培养标志着细胞大规模培养技术的开始。上世纪八十年代后，CHO细胞实现悬浮培养，治疗性抗体生产技术的发展极大的推动着生物反应器在生物制药行业的应用，到上世纪末已进入万升规模。本世纪初，随着流加培养、灌注培养、个性化培养基等技术的发展，作为大规模培养主要设备的生物反应器规模也趋向大型化和简单化。当前生物制药的主流技术是在大型机械搅拌式反应器中，用无血清培养基和流加工艺悬浮培养细胞进行生产。

动物细胞大规模培养生产生物制品的应用领域在快速发展，全球销售额最高的6大类生物技术药中，5类是经哺乳动物细胞表达生产的。现代基因工程技术及个性化培养基技术的发展，促进细胞培养制药的快速发展。国际知名厂家纷纷进行细胞改造筛选，发展自己的细胞培养平台。反观国内，人用和兽用疫苗企业超过120家，应用生物反应器进行生产的不多，大多还是小规模的试验阶段，与国外万升级规模相比还较大的差距。

2.细胞培养工艺中的关键技术

悬浮培养技术主要包括高表达细胞株的获得、个性化培养基、细胞反应器及配套设施的完善、生产工艺的优化等四个方面。

2.1细胞的驯化与保藏

为了提高生物制品的产率和安全有效性，筛选高表达量的宿主细胞意义重大。

细胞筛选驯化的实质是应用现代细胞生物学技术，在降低细胞凋亡率、提高细胞活力、延长细胞生命周期、提高产物浓度等方面的研究，结合特定细胞的营养需求进行培养基优化，筛选适合生产的细胞株

为实现驯化稳定，通常有高密度细胞培养向低密度细胞培养，由高浓度血清培养逐渐向降低血清浓度培养。因细胞损伤后很难修复，所以驯化活力应保持在90%以上。细胞的增殖能力直接影响产能，驯化时应保持对其增殖能力测定。驯化时还应该对其表达分泌能力进行测定，避免驯化后的细胞表达特性发生变化。

在筛选驯化过程中应该注意及时对细胞进行保藏，保藏时选择细胞状态好的细胞。

2.2细胞培养基的个性化和优化

大规模培养技术中，维持高密度甚至无血清生长，细胞培养基的营养含量对细胞增殖、维持至关重要。不同细胞需要提高目标生物制品的稳定性、表达量均需要个性化培养基的支持。研究表明，采用个性化培养基与目录培养基相比，表达量提高了9.6倍。个性化培养基在国外生物制品生产被普遍采用。

2.3悬浮培养工艺研发

悬浮培养过程技术是生产工艺的开发和过程的优化。

2.3.1悬浮培养和微载体培养工艺

悬浮培养技术分为悬浮细胞培养工艺、贴壁细胞微载体悬浮培养工艺、纸片载体固定床工艺。悬浮细胞可以直接增殖，细胞自由生长、环境均一、取样简单、操作简单、放大方便、污染率低和成本低；贴壁细胞需要借助微载体和纸片载体，营养环境差，培养、取样观察及放大工艺复杂，成本更高。

2.3.2悬浮培养工艺及选择

细胞悬浮培养工艺按照培养方式分为批次培养、流加培养及灌注培养。批次培养能直接反映细胞在反应器中的生长、代谢变化，操作简单，但初期代谢产物多，抑制细胞生长，细胞密度不高。流加培养操作简单、产率高、容易放大、应用广泛，但需要流加设计。灌注培养培养体积小，回收体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收低温保存利于产品活性，但操作繁杂、培养基利用率低、旋转过滤器容易堵塞。

不同工艺采用培养方式不同，分泌性且活性降低快的制品宜采用灌注培养，且灌注培养也适合微载体培养，同一制品由于营养环境不同其工艺也会发生变化，如BHK21细胞生产口蹄疫，低血清培养采用批次培养，接毒前更换无血清维持。而无血清培养中无需换液，配合流加培养更好。选择工艺要考虑细胞株、产物稳定、培养基或者添加物、培养规模等几个因素。

2.3.3悬浮培养过程参数控制

选择合适的工艺后，过程控制成为关键。为了保持最优环境中培养细胞，需要利用在线监控功能控制各种运行参数。

细胞对温度敏感，需要采用合适的加热或冷却方式控制培养温度在35-37℃，避免细胞受到损伤。

动物细胞适宜的生长范围一般在6.8-7.3之间，低于6.8或高于7.3都可能对细胞生长产生不利影响。对CHO细胞分别在PH为7.0和7.3条件下培养，结果表明PH7.0时细胞密度是7.3的近2倍，生产率是其2.5倍。因此，合适的PH控制对产率有较大影响。

溶氧控制同样重要，其范围通常为20-60%的空气饱和度，应该注意通气量，避免气泡的破裂对细胞造成损伤，同时通气量会影响PH值，需要综合考虑。

培养过程中还要注意渗透压，大多数动物细胞适宜的渗透压范围是280-320mosm/kg H₂O左右，加碱控制PH值时要注意监测。

此外，还要进行流加方式、灌注速率及代谢产物的控制等，在整个工艺优化过程中，各个参数不是单一运行，且相互影响，需要进行全面控制。

2.4生物反应器选择

反应器规模能否放大是选择反应器的一个重要前提，放大主要通过增大体积或者增加数量，增大体积可以节约配套和人员成本，增加数量虽然操作灵活，但成本高。国外主要采用逐级放大的生物反应器。选择反应器需要考虑满足生产工艺和产能，另外，接口的标准化、配件供应速度、售后服务质量都是选型需要考虑的，以免造成生产延误。

3.国内悬浮培养技术产业化存在的挑战和前景

国际上反应器悬浮培养技术已经广泛应用于生物制药生产，且在高效表达细胞株的构建、个性化培养基的研发等方面不断发展。大量新建的反应器和产物表达量的提高已经导致产能过剩，发达国家市场出现饱和、向发展中国家扩张的趋势。各大生物制药巨头开始通过并购或合作等方式进入新兴的中国市场并投入大量资金，快速进入中国生物制药行业。

应该认识到，快速实现悬浮培养技术在生产中只是搭建一个升级的工艺平台，而不是最终目的，行业和企业发展的真正动力是新药、新工艺及配套技术创新。例如，无血清技术开发，利用合适的培养基和转染或者驯化技术实现贴壁细胞的悬浮培养构建，新宿主细胞表达品种开发，利用基因工程技术开发新抗体品种，以及生物制品相关关键技术和产品的国产化。

4.结语

    快速实现悬浮培养技术在生物制药行业生产中的升级换代是未来几年行业重点，这个过程应重视成熟技术、成功率，以减少和避免时间、资金、人力等资源的浪费，减少机会成本，抢占市场先机。悬浮培养技术的升级将导致行业整合与重组，生物制药将出现明显的集约化趋势，有实力的企业将不断以创新药、新技术新工艺研发为基础和核心竞争力，同时借助资金实力整合制造和营销体系，成为行业龙头。